重組人源化膠原蛋白原材料評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則

（征求意見稿）?

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)植入類醫(yī)療器械所用重組人源化膠原蛋白原材料進(jìn)行充分的研究，并整理形成產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)重組人源化膠原蛋白制成的產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料包括所引用主文檔內(nèi)容的技術(shù)審評(píng)提供參考。本指導(dǎo)原則主要針對(duì)植入類醫(yī)療器械的重組人源化膠原蛋白原材料的評(píng)價(jià)，其它醫(yī)療器械用重組膠原蛋白原材料的評(píng)價(jià)也可以參考本指導(dǎo)原則適用的部分。

本指導(dǎo)原則系對(duì)醫(yī)療器械用重組人源化膠原蛋白原材料的一般要求，適用于人膠原蛋白的所有型別，注冊(cè)申請(qǐng)人需依據(jù)具體醫(yī)療器械產(chǎn)品的特性對(duì)產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料涉及的原材料相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容的適用性。本指導(dǎo)原則不直接涉及重組人源化膠原蛋白材料制成的醫(yī)療器械終產(chǎn)品的安全性或有效性評(píng)價(jià)，具體產(chǎn)品的評(píng)價(jià)請(qǐng)參考相應(yīng)的產(chǎn)品注冊(cè)審查指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是對(duì)注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，

如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用

，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料；需在遵循相關(guān)法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。

一、前言

近年來，隨著基因重組、蛋白質(zhì)組學(xué)等基礎(chǔ)理論、技術(shù)手段和臨床醫(yī)療探索研究的不斷發(fā)展，重組膠原蛋白日益成為重要的生物材料，為相關(guān)醫(yī)療器械的研發(fā)提供了新的思路與方法。重組人源化膠原蛋白是由DNA重組技術(shù)制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長(zhǎng)或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合。

重組人源化膠原蛋白僅是重組膠原蛋白的一類，材料特性并不能完全決定最終產(chǎn)品的安全性和有效性。本指導(dǎo)原則中的“原材料”是指用于生產(chǎn)制造醫(yī)療器械用的重組人源化膠原蛋白材料。

重組人源化膠原蛋白是通過基因工程生產(chǎn)的蛋白，工程細(xì)胞構(gòu)建過程、生產(chǎn)用細(xì)胞的質(zhì)量控制及常規(guī)生產(chǎn)過程控制是該原材料生產(chǎn)工藝及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)，此方面主要的驗(yàn)證資料，可參考本指導(dǎo)原則的資料性附錄作為材料生物安全性研究資料的補(bǔ)充，但不作為產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料或主文檔的必要內(nèi)容。結(jié)合重組人源化膠原蛋白的特點(diǎn)，該附錄修改引用了國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心《重組制品生產(chǎn)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)量控制技術(shù)評(píng)價(jià)一般原則》、《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》等生物制品指導(dǎo)原則的相關(guān)內(nèi)容。

二、評(píng)價(jià)要點(diǎn)

（一） 重組人源化膠原蛋白原材料性能研究

為了確保重組人源化膠原蛋白原材料質(zhì)量可控，重組人源化膠原蛋白應(yīng)參考相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行必要的鑒別、純度和雜質(zhì)等分析，可采用不同的分析方法對(duì)材料的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸序列、各種翻譯后修飾（如脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾、脯氨酸羥基化等）進(jìn)行充分鑒定，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)臋z測(cè)，以確認(rèn)終產(chǎn)物具有預(yù)期的構(gòu)象、聚集狀態(tài)、降解狀態(tài)及膠原蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)。

材料理化特性分析需按照醫(yī)療器械制備工藝和特點(diǎn)，結(jié)合其風(fēng)險(xiǎn)控制要求進(jìn)行相關(guān)研究，建議對(duì)如下常規(guī)理化項(xiàng)目進(jìn)行研究，例如氨基酸序列、蛋白空間結(jié)構(gòu)、劑型（如溶液、凍干粉、凝膠、纖維、海綿等）、膠原蛋白型別等特異性性能，同時(shí)結(jié)合醫(yī)療器械特點(diǎn)，完善理化性能指標(biāo)要求。

需根據(jù)不同的預(yù)期用途及使用部位、不同生產(chǎn)工藝、預(yù)期使用效果和最終醫(yī)療器械的狀態(tài)，選擇適用的指標(biāo)；根據(jù)膠原蛋白材料是否經(jīng)過交聯(lián)或化學(xué)修飾，宜提供交聯(lián)劑或修飾劑的殘留量、降解周期等性能的檢測(cè)指標(biāo)，提供相應(yīng)的檢測(cè)報(bào)告。

檢測(cè)的必要性和純度等指標(biāo)要求取決于膠原蛋白材料性質(zhì)和用途、生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn)工藝的經(jīng)驗(yàn)等多種因素。新的分析技術(shù)及對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)正在不斷進(jìn)行，適當(dāng)時(shí)應(yīng)使用這些新的技術(shù)。

1.鑒別

1.1氨基酸序列及覆蓋度

首先需明確氨基酸序列的選擇依據(jù)，如為特定氨基酸序列片段組成的，還需明確片段重復(fù)次數(shù)及依據(jù)。需采用綜合的方法測(cè)定目標(biāo)膠原蛋白材料的氨基酸序列，并與其基因序列對(duì)應(yīng)的理論氨基酸序列進(jìn)行比較驗(yàn)證。肽段覆蓋率的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為100%覆蓋，末端氨基酸序列檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與理論序列完全一致。

如適用，目標(biāo)膠原蛋白材料的理論氨基酸序列應(yīng)包括二硫鍵連接方式。氨基酸序列測(cè)定還應(yīng)考慮可能存在的N端甲硫氨酸(如大腸桿菌來源的膠原蛋白材料），信號(hào)肽或前導(dǎo)序列和其他可能的N端、C端修飾（如乙?；?、酰胺化或者由于外肽酶導(dǎo)致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等），以及各種其他異質(zhì)性（如脫酰胺化、氧化、異構(gòu)化、碎片化、二硫鍵錯(cuò)配、N-連接和O-連接的寡糖、糖基化、聚集等）。

1.1.1氨基酸組成

使用各種水解法和分析手段測(cè)定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸組成或天然異構(gòu)體比較。如需要時(shí)應(yīng)考慮分子量的大小。多數(shù)情況下，氨基酸組成分析對(duì)肽段和小蛋白可提供有價(jià)值的結(jié)構(gòu)資料，但對(duì)大蛋白一般意義較小。在多數(shù)情況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。

1.1.2氨基酸末端序列

氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質(zhì)和同質(zhì)性。若發(fā)現(xiàn)目的膠原蛋白材料的末端氨基酸發(fā)生改變時(shí)，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應(yīng)變異數(shù)量。應(yīng)將這些氨基酸末端序列與來自目的膠原蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列進(jìn)行比較。用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法測(cè)定N端和/或C端氨基酸序列，其結(jié)果應(yīng)符合理論預(yù)測(cè)（每年應(yīng)至少做一次）。

1.2 肽圖

按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部 通則 肽圖檢查法 第一法 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，建立膠原蛋白材料標(biāo)準(zhǔn)肽圖。

推薦利用四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF MS）建立標(biāo)準(zhǔn)肽圖，作為膠原蛋白材料的指紋圖譜，用于材料的批間一致性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，以及材料特異性的鑒別。

應(yīng)用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的材料片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽，應(yīng)用HPLC或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠巍?yīng)盡量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)，N-末端測(cè)序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。對(duì)材料成品放行來說,經(jīng)驗(yàn)證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的材料結(jié)構(gòu)/鑒別的適當(dāng)方法。

1.3 分子量

對(duì)申報(bào)醫(yī)療器械所用膠原蛋白材料可參照《中華人民共和國(guó)藥典》高效液相色譜法、電泳法第五法SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳法，以及具有Marker的SDS-PAGE方法、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜方法建立分子量及分布檢測(cè)方法，也可以運(yùn)用其他適當(dāng)技術(shù)測(cè)定分子量，如分子篩層析法等。

高分辨質(zhì)譜法分子量應(yīng)與參比品一致；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分子量電泳條帶位置應(yīng)與參比品一致。

1.4 等電點(diǎn)

按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 電泳法第六法（等電聚焦電泳法）或0542毛細(xì)管電泳法進(jìn)行檢測(cè)，等電點(diǎn)應(yīng)在標(biāo)示范圍內(nèi)，也可以運(yùn)用其他適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定。

1.5 巰基和二硫鍵

如果目的膠原蛋白材料的基因序列存在半胱氨酸殘基時(shí)，應(yīng)盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜測(cè)定法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ā?/span>

1.6 碳水化合物結(jié)構(gòu)

應(yīng)測(cè)定糖蛋白中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外，盡可能分析碳水化合物的結(jié)構(gòu)、寡糖形態(tài)（長(zhǎng)鏈狀）和多肽的糖基化位點(diǎn)。

1.7消光系數(shù)（或克分子吸光度）

多數(shù)情況下，可取目的膠原蛋白材料于UV/可見光波長(zhǎng)處測(cè)定消光系數(shù)（或克分子吸光度）。消光系數(shù)的測(cè)定為使用UV/可見光或分光光度計(jì)檢測(cè)已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)或定氮法等方法測(cè)定。

1.8電泳圖型

應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SDS－PAGE電泳、免疫印跡、毛細(xì)管電泳法或其他適當(dāng)?shù)姆椒?獲得目的膠原蛋白材料的一致性,同一性和純度的電泳圖譜和數(shù)據(jù)。

1.9液相層析圖譜

應(yīng)用分子篩層析、反相液相層析、離子交換液相層析、親和層析或其他適當(dāng)方法，獲得目的膠原蛋白材料的一致性、同一性和純度的層析圖譜和數(shù)據(jù)。

2.結(jié)構(gòu)表征

2.1 氨基酸異質(zhì)性分析

2.1.1 脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾等

適用時(shí)，應(yīng)按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的要求進(jìn)行分析。

2.1.2 脯氨酸羥基化

若在設(shè)計(jì)是進(jìn)行脯氨酸羥基化，應(yīng)按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的規(guī)定進(jìn)行分析，并規(guī)定標(biāo)示值。

2.2 高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

鑒于高級(jí)結(jié)構(gòu)與重組人源化膠原蛋白表現(xiàn)出的性能和功能密切相關(guān)，鼓勵(lì)采用多種方法對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析，包括以下列舉的方法及其他結(jié)構(gòu)表征方法，如冷凍電鏡、蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)等方法。

2.2.1三螺旋結(jié)構(gòu)

可采用圓二色譜在特定實(shí)驗(yàn)條件下的檢測(cè)結(jié)果反映膠原蛋白材料在該條件下可（否）具有形成三螺旋結(jié)構(gòu)能力；可采用X射線晶體學(xué)技術(shù)或冷凍電鏡技術(shù)在原子結(jié)構(gòu)水平考證膠原蛋白材料或其包含的特定氨基酸序列的三螺旋結(jié)構(gòu)特性，計(jì)算有結(jié)構(gòu)信息的序列占整個(gè)蛋白序列的百分比X%；可采用差示掃描量熱譜檢測(cè)膠原蛋白材料結(jié)構(gòu)變化的熱效應(yīng)輔助說明膠原蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)特征；可采用紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，其非特征區(qū)（如：酰胺a、b）和特征區(qū)（如:酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置應(yīng)與參比品一致；可采用拉曼光譜，其拉曼光譜圖應(yīng)與參比品一致；也可應(yīng)用其它紫外或可見光吸收光譜法、核磁共振（NMR）等適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)。

2.2.2纖維質(zhì)量/多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

適用時(shí)，使用TEM 或AFM觀察膠原蛋白材形成膠原纖維束/多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等，須明確兩種方法具體的制樣和觀察測(cè)定過程。

3.純度

關(guān)于純度的要求可視醫(yī)療器械終產(chǎn)品的用途和用法而確定，作為原材料，建議一般應(yīng)≥95%。

4.含量

應(yīng)建立重組人源化膠原蛋白含量檢測(cè)方法，含量以質(zhì)量/重量或質(zhì)量/體積表示。含量檢測(cè)可通過液相色譜法（HPLC）、凱氏定氮法、特征多肽法等，應(yīng)在標(biāo)示量的90%～110%之間。

5.雜質(zhì)、污染物和添加劑

對(duì)膠原蛋白材料工藝相關(guān)雜質(zhì)以及外源污染物等進(jìn)行研究，如：細(xì)胞基質(zhì)來源、細(xì)胞培養(yǎng)來源和下游工藝。應(yīng)對(duì)潛在的工藝相關(guān)雜質(zhì)（如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞DNA、細(xì)胞培養(yǎng)殘留物、下游工藝的殘留物等）進(jìn)行鑒別、評(píng)估，并進(jìn)行定性和/或定量分析，并采用適宜的方法評(píng)價(jià)其對(duì)生物學(xué)功能的影響。工藝相關(guān)雜質(zhì)來源于生產(chǎn)工藝，可分三大類：來源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝。細(xì)菌內(nèi)毒素、微生物限度和無菌性，是常規(guī)的污染物控制要求。

5.1源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)

來源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)包括源于宿主生物體的蛋白/多肽；核酸（宿主細(xì)胞/載體/總DNA）；多糖及病毒。對(duì)于宿主細(xì)胞蛋白，一般應(yīng)用能檢測(cè)出較寬范圍蛋白雜質(zhì)的靈敏的免疫檢測(cè)方法。應(yīng)用不含目的基因的生物體粗提物，即不含膠原蛋白編碼基因的生產(chǎn)用細(xì)胞，制備上述試驗(yàn)使用的多克隆抗體?？赏ㄟ^對(duì)膠原蛋白材料的直接分析方法（如雜交技術(shù)法）檢測(cè)宿主細(xì)胞的DNA水平，和/或通過標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)室規(guī)模）檢測(cè)證實(shí)通過純化工藝能去除核酸。對(duì)于有意導(dǎo)入的病毒，應(yīng)驗(yàn)證生產(chǎn)工藝中去除/滅活病毒的能力。

5.1.1外源性DNA殘留量

按照《中華人民共和國(guó)藥典》“外源性DNA殘留量測(cè)定法”的“熒光染色法”或“定量PCR法”進(jìn)行測(cè)定，“熒光染色法”的樣品加標(biāo)回收率應(yīng)滿足70%～130%；“定量PCR法”的樣品加標(biāo)回收率應(yīng)滿足50%～150%，應(yīng)規(guī)定殘留限量。如果樣品中外源性DNA殘留量低于“熒光染色法”的檢測(cè)限，則應(yīng)采用“定量PCR法”進(jìn)行測(cè)定。

宜根據(jù)醫(yī)療器械產(chǎn)品的預(yù)期臨床用途（作為植人物在體內(nèi)使用，還是作為敷料等在體表、粘膜使用）、使用量等，確定含重組膠原蛋白的材料臨床最大使用量的外源性DNA殘留量限值。如果重組膠原蛋白產(chǎn)品預(yù)期為體內(nèi)植人劑，推薦參考生物制品外源性DNA殘留限量要求，結(jié)合殘留DNA宿主類型及其風(fēng)險(xiǎn)程度設(shè)定每人每次最大使用量限值。

建議參考生物制品中大腸桿菌或酵母菌表達(dá)的基因工程重組生物制品的外源性DNA殘留量限度，如注射用生物制品≤10ng/劑，CHO細(xì)胞表達(dá)的基因工程重組產(chǎn)品外源性DNA殘留量≤100pg/劑(10000IU）等。

5.1.2宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量

5.1.2.1大腸桿菌蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國(guó)藥典》“大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法”或采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果應(yīng)在總蛋白的0.05%以下（體內(nèi)植人）。

5.1.2.2酵母蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國(guó)藥典》“酵母工程茵茵體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法” 或采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果應(yīng)在總蛋白的0.05%以下（體內(nèi)植入）。

5.1.2.3 CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量

采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定，CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量應(yīng)在總蛋白的0.05%以下（體內(nèi)植入）。

5.1.3促炎性污染物（肽聚糖）

采用經(jīng)驗(yàn)證的方法或經(jīng)驗(yàn)證的市售細(xì)菌肽聚糖檢測(cè)試劑盒（ELISA）檢測(cè)殘留肽聚糖，應(yīng)根據(jù)其致熱反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)規(guī)定可接受的限量要求。

5.2 源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)

來源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)包括誘導(dǎo)劑（多核苷酸,病毒）、抗生素、血清及其他培養(yǎng)基組分。應(yīng)根據(jù)工藝中采用的表達(dá)體系和使用的抗生素類型，采用經(jīng)驗(yàn)證的方法測(cè)定殘余抗生素含量/活性，殘余抗生素含量應(yīng)≤50ng/mg，不應(yīng)有殘余抗生素活性。

殘余抗生素含量的測(cè)定按照YY/T 1849《重組膠原蛋白》中描述的方法或其他經(jīng)驗(yàn)證的方法進(jìn)行檢測(cè)，殘余抗生素活性按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 生物活性測(cè)定法中抗生素微生物檢定法或《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 抗生素殘留量檢查法進(jìn)行檢測(cè)。

5.3 源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)

來源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)一般包括酶、化學(xué)/生化處理試劑（如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑）、無機(jī)鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載體/配體（如單克隆抗體），及其他可濾過的物質(zhì)。需結(jié)合實(shí)際情況制定相關(guān)理化指標(biāo)。

5.3.1 添加劑

如果使用了防腐劑、凍干保護(hù)劑等添加劑，應(yīng)給出其限量要求和檢測(cè)方法。

5.3.2 重金屬及微量元素含量應(yīng)符合以下規(guī)定。

5.3.2.1重金屬元素

對(duì)工藝中添加的重金屬元素，應(yīng)符合規(guī)定限值。

5.3.2.2重金屬含量

重金屬總量（以Pb計(jì)）應(yīng)≤10μg/g。

5.3.2.3微量元素含量

微量元素含量：砷（As）≤1 μg/g，汞（Hg）≤4 μg/g，鉛（Pb）≤10μg/g，鉻（Cr）、鎘（Cd）、銅（Cu）、鉬（Mo）、鐵（Fe）、鎳（Ni）總量應(yīng)≤50μg/g。

5.4 細(xì)菌內(nèi)毒素

關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素相關(guān)限值需結(jié)合醫(yī)療器械終產(chǎn)品的用途及用法進(jìn)行設(shè)定。

5.5 微生物限度

若膠原蛋白材料以微生物限度控制狀態(tài)提供，按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法和、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)要求。

5.6 無菌性

若膠原蛋白材料以無菌狀態(tài)提供，按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 無菌檢查法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)無菌。

6.分子變異體

建議對(duì)膠原蛋白材料的各種分子變異體進(jìn)行分離、鑒別和分析。如變異體的功能與目標(biāo)產(chǎn)物一致時(shí)可不做雜質(zhì)考慮。應(yīng)考慮在生產(chǎn)和/或貯存期間膠原蛋白材料降解產(chǎn)物是否顯著增加及其與免疫原性的相關(guān)性。以下為最常見的目的膠原蛋白材料的分子變異體，并列出了相應(yīng)的檢測(cè)方法：

6.1 化學(xué)修飾類型

應(yīng)考慮脫酰胺、異構(gòu)化、錯(cuò)配S-S連接和氧化形式的分離和鑒別。對(duì)這些變異體的分離和鑒別，可應(yīng)用層析法和/或電泳法（如HPLC、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜法、圓二色譜）。

6.2 降解物和聚合體

降解物和聚合體：聚合體包括二聚體和多聚體，可用分子篩層析法（如SE-HPLC）進(jìn)行定量；應(yīng)建立降解物的判定標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)穩(wěn)定性試驗(yàn)產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

7.熱穩(wěn)定性

如果重組膠原蛋白是多聚體，可采用差示掃描量熱分析（DSC）進(jìn)行解聚溫度分析?？蓞⒖肌吨腥A人民共和國(guó)藥典》 四部。

如果是單鏈的蛋白肽，可參考《中華人民共和國(guó)藥典》 四部,人免疫球蛋白3.3.2.4熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，將供試品置（57±0.5）℃水浴中保溫4 h后，用可見異物檢查裝置，肉眼觀察應(yīng)無凝膠化或絮狀物。

8.降解特性及產(chǎn)物

應(yīng)對(duì)膠原蛋白材料降解特性進(jìn)行研究，可采用GPC測(cè)定降解產(chǎn)物的分子量分布及分子量，水解/酶解產(chǎn)物可使用氨基酸分析儀、高效液相色譜或其他適宜的方法測(cè)定。

9.其它理化指標(biāo)

膠原蛋白材料其它性能指標(biāo)宜根據(jù)醫(yī)療器械終產(chǎn)品特性及相關(guān)通用要求制定，在適用時(shí)，需對(duì)相關(guān)性能指標(biāo)檢測(cè)方法使用的對(duì)照品進(jìn)行性能研究，對(duì)照品技術(shù)參數(shù)應(yīng)明確且性能穩(wěn)定。用于理化測(cè)定等方面的對(duì)照品，應(yīng)進(jìn)行必要的分析鑒定，包括但不限于：

9.1 外觀（如性狀、顏色）

用肉眼直接觀測(cè)，應(yīng)為白色/淡黃色/無色透明液體或凝膠，或白色/類白色凍干粉或海綿狀固體。

注：隨著行業(yè)發(fā)展，可能存在其他外觀要求，應(yīng)根據(jù)原材料具體形態(tài)規(guī)定外觀要求。

9.2 可見異物

按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 可見異物檢查法第一法（燈檢法）進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)無明顯異物。

9.3 溶解性

應(yīng)根據(jù)供試品的溶解特性，對(duì)供試品在水、稀酸或中性鹽溶液中的溶解程度進(jìn)行表征和闡述。稱取適量樣品，于25℃±2℃一定體積的溶劑中，每隔5min強(qiáng)力振搖30s；觀察30min內(nèi)的溶解情況，如無目視可見的溶質(zhì)顆?；蛞旱螘r(shí)，即視為完全溶解。

表7 水溶解性/鹽溶解性

9.4 水分

適用時(shí)（如凍干樣品），水分含量應(yīng)≤10%。除另有規(guī)定外，取供試品約1 g～2 g，按照《中華人民共和國(guó)藥典》“水分測(cè)定法”第二法（烘干法）測(cè)定，或取供試品約10 mg 按照《中華人民共和國(guó)藥典》“熱分析法”熱重法（TG）測(cè)定，升溫程序：從室溫以10 ℃/min 速率升溫至105 ℃，保持60 min。減失重量應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。規(guī)定仲裁方法為水分測(cè)定法。

9.5 熾灼殘?jiān)?/span>

除另有規(guī)定外，取1.0-2.0g，按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 熾灼殘?jiān)鼨z查法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)≤2%。

9.6 酸堿度

液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL，按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則“pH值測(cè)定法”進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)符合所標(biāo)示值的±1.0，一般應(yīng)在5.5-8.0之間。

9.7 滲透壓摩爾濃度

液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 滲透壓摩爾濃度測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)，滲透壓摩爾濃度范圍應(yīng)280-360 mOsmol/kg之間。

9.8 動(dòng)力黏度（凝膠）

取供試品按照《中華人民共和國(guó)藥典》“黏度測(cè)定法”的“旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)定法”測(cè)定，需要詳細(xì)描述試驗(yàn)條件，動(dòng)力黏度值應(yīng)符合所標(biāo)示范圍。

9.9 裝量及差異

根據(jù)供試品性狀（溶液、凝膠、凍干海綿或凍干粉末等）和裝量的不同確定裝量的允差要求。單個(gè)裝量不低于標(biāo)示裝量的93%,平均裝量不低于標(biāo)示裝量。

9.10 掃描電鏡觀察

適用時(shí)，重組人源化膠原蛋白固體在掃描電鏡下觀察，圖像整體應(yīng)與參比品保持一致。

10.生物學(xué)功能評(píng)價(jià)

重組膠原蛋白的生物學(xué)功能是指以重組膠原蛋白生物學(xué)特性相關(guān)屬性為基礎(chǔ)的生物學(xué)作用，對(duì)聲稱的生物學(xué)功能宜進(jìn)行定性定量分析。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，重組膠原蛋白的主要生物學(xué)功能是為細(xì)胞提供支架和良好的微環(huán)境，如促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、生長(zhǎng)、分化等。因此，可通過評(píng)價(jià)細(xì)胞-膠原蛋白相互作用來評(píng)價(jià)重組膠原蛋白的生物學(xué)功能。細(xì)胞增殖、分化、黏附性、遷移或移行評(píng)價(jià)方法可參考YY/T 1849《重組膠原蛋白》。

細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)基于膠原蛋白-細(xì)胞相互作用通過生物化學(xué)和生物物理兩個(gè)方面進(jìn)行調(diào)控。膠原蛋白固有的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)能力在很大程度上受以下三個(gè)方面驅(qū)動(dòng)：支持整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附；通過結(jié)構(gòu)和材料特性施加物理和機(jī)械的作用；參與細(xì)胞誘導(dǎo)的動(dòng)態(tài)重建過程（如生物降解，結(jié)合生長(zhǎng)因子，和微結(jié)構(gòu)的變形）。

由于膠原類材料在分子組成、微結(jié)構(gòu)、物理性能方面可能差異顯著，應(yīng)檢測(cè)材料與細(xì)胞之間相互作用及其引導(dǎo)細(xì)胞基礎(chǔ)響應(yīng)的性能。細(xì)胞響應(yīng)的參數(shù)包括：細(xì)胞形態(tài)、面積和體積，均可通過二維（2D）或三維（3D）圖像技術(shù)可視化評(píng)價(jià)。細(xì)胞骨架成分（如肌動(dòng)蛋白）的協(xié)同作用被用來評(píng)價(jià)細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附與收縮解離。

測(cè)試過程中，在膠原聚合之前通過把細(xì)胞混懸在膠原溶液中，細(xì)胞很容易進(jìn)入自組裝膠原網(wǎng)內(nèi)，或者將細(xì)胞接種到自組裝后的膠原材料表面?？贵w阻斷試驗(yàn)可用來確定細(xì)胞表面的何種受體參與了與膠原的作用，如整合素或盤狀結(jié)構(gòu)域受體（DDRs）。

在單個(gè)細(xì)胞或多細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)細(xì)胞引導(dǎo)的收縮解離的方法有多種。自由漂浮組織構(gòu)建物的尺寸隨時(shí)間的變化、施加在培養(yǎng)-力學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)上力的大小、以及單個(gè)細(xì)胞在膠原網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)力和形變。

常規(guī)檢測(cè)的細(xì)胞響應(yīng)參數(shù)還包括：存活率，增殖率，程序化凋亡以及遷移。

其它適用于干細(xì)胞和祖細(xì)胞類型的細(xì)胞-膠原相互作用的功能性檢測(cè)包括細(xì)胞株的定向分化，特定干細(xì)胞或祖細(xì)胞的增殖，或組織形態(tài)發(fā)生（始于內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管形成）。

按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部 進(jìn)行成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性測(cè)定，對(duì)膠原蛋白肽-細(xì)胞相互作用評(píng)價(jià)，反映膠原蛋白肽與成纖維細(xì)胞增殖的構(gòu)效關(guān)系。按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部 生物活性測(cè)定法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括對(duì)驗(yàn)證指標(biāo)結(jié)果的繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以及判斷其是否符合可接受標(biāo)準(zhǔn)等。常規(guī)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法一般要求數(shù)據(jù)之間相互獨(dú)立，并呈近似正態(tài)分布和方差齊性，通常采用相對(duì)效價(jià)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)無法滿足上述統(tǒng)計(jì)學(xué)要求時(shí)，也可考慮采用其他適宜的替代方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

上述關(guān)于膠原—細(xì)胞相互作用的功能性測(cè)定也可作為醫(yī)療器械產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的方法。三維支架材料中細(xì)胞活性評(píng)價(jià)方法可參考YY/T 1562《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 生物材料支架 細(xì)胞活性試驗(yàn)指南》。