刺激性試驗

定義：

   刺激性是指非口服給藥制劑給藥后對給藥部位產(chǎn)生的可逆性炎癥反應(yīng)，若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。刺激性試驗是觀察動物的血管、肌肉、皮膚、粘膜等部位接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應(yīng)。

SPRING DRFAMS

刺激性試驗

定義：

   刺激性是指非口服給藥制劑給藥后對給藥部位產(chǎn)生的可逆性炎癥反應(yīng)，若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。刺激性試驗是觀察動物的血管、肌肉、皮膚、粘膜等部位接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應(yīng)。

SPRING DRFAMS

刺激性試驗方法：

01血管刺激性試驗

通常選兔，每組不少于3只。設(shè)生理鹽水和/或溶媒對照，可采用同體左右側(cè)自身對比法。給藥部位根據(jù)臨床擬用途徑確定，一般選用耳緣靜脈?？稍O(shè)多個給藥濃度，至少包括臨床最大擬用濃度，給藥容積、速率和期限一般根據(jù)臨床擬用法用量，并根據(jù)動物情況進(jìn)行調(diào)整，給藥體積不可太低。多次給藥時間一般不超過7天。

根據(jù)受試藥物的特點和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時間和剖檢時間，至少觀察72小時。應(yīng)對部分動物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查?；謴?fù)期動物根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)情況，繼續(xù)觀察14～21天進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)肉眼觀察和組織病理學(xué)檢查結(jié)果綜合判斷受試物的血管刺激性及刺激性恢復(fù)情況。

02肌肉刺激性試驗

通常選兔，也可選用大鼠。每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對照或/和溶媒對照組，可采用同體左右側(cè)自身對比法。根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時間, 觀察期結(jié)束時應(yīng)對部分動物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。分別在左右兩側(cè)股四頭肌內(nèi)注射給藥，觀察給藥后不同時間的局部反應(yīng)，如充血、紅腫等。給藥后48～72小時剖檢觀察注射局部的刺激反應(yīng)，按表1計算相應(yīng)的反應(yīng)級，并進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查，提供病理照片。

根據(jù)表1計算肌肉刺激性總反應(yīng)級，計算平均值，按表2判定刺激等級。若各股四頭肌反應(yīng)級的最高與最低之差大于2，應(yīng)另取動物重新試驗。

表1  肌肉刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)

表2  平均分值和等級

03皮膚刺激性試驗

定義：皮膚刺激性是指經(jīng)皮膚給藥后，在皮膚上產(chǎn)生的可逆性炎性病變。若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。皮膚刺激性試驗是觀察動物的皮膚接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出等局部反應(yīng)。

通常選兔、小型豬，否則應(yīng)闡明合理性。兔每組不低于4只。一般應(yīng)進(jìn)行相同備皮面積的正常皮膚和破損皮膚局部刺激性試驗。

采用同體左右側(cè)自身對比法，將受試物直接涂于備皮處，敷料覆蓋固定。貼敷時間至少4小時。多次給藥皮膚刺激性試驗應(yīng)連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時間相同，給藥期限一般不超過4周。破損皮膚試驗中皮膚破損程度以損傷表皮層為限。

在自然光線或全光譜燈光下肉眼觀察皮膚反應(yīng)。根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時間。通常單次給藥皮膚刺激性試驗觀察時間點為去除藥物后30～60分鐘，24、48和72小時。多次給藥皮膚刺激性試驗，為每次去除藥物后1小時以及每次給藥前，以及末次貼敷去除藥物后30～60分鐘，24、48和72小時。

如存在持久性損傷，有必要延長觀察期限以評價恢復(fù)情況和時間，延長期一般不超過2周。對出現(xiàn)中度及中度以上皮膚刺激性的動物應(yīng)在觀察期結(jié)束時進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，并提供病理照片。

單次給藥皮膚刺激性試驗，計算各組每一時間點皮膚反應(yīng)積分的平均值，按表3進(jìn)行刺激強(qiáng)度評價。多次給藥皮膚刺激性試驗，首先計算每一觀察時間點各組積分均值，然后計算觀察期限內(nèi)每天每只動物刺激積分均值，按表4進(jìn)行刺激強(qiáng)度評價。

表3  皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

表4  皮膚刺激強(qiáng)度評價標(biāo)準(zhǔn)

04粘膜刺激性試驗

4.1眼刺激性試驗

通常選兔，每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對照組，可采用同體左右側(cè)自身對比法。動物眼睛滴入受試物，保證藥物充分暴露。給藥期限應(yīng)根據(jù)臨床擬用方法確定。多次給藥時每天給藥次數(shù)應(yīng)不少于臨床用藥頻率。

應(yīng)根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)挠^察時間。通常單次給藥為給藥后1、2、4、24、48和72小時；多次給藥眼刺激試驗為每天給藥前以及最后一次給藥后1、2、4、24、48和72小時。如存在持久性損傷，有必要延長觀察期限，一般不超過21天。

一般采用裂隙燈進(jìn)行眼刺激反應(yīng)檢查，也可根據(jù)刺激性反應(yīng)情況采用其他的合適器械。在整個觀察過程中應(yīng)進(jìn)行熒光素鈉染色檢查。每次檢查都應(yīng)記錄眼部異常反應(yīng)，根據(jù)表5計算分值。根據(jù)表6判斷刺激程度。

表5  眼刺激反應(yīng)分值標(biāo)準(zhǔn)

表6  眼刺激性評價標(biāo)準(zhǔn)

4.2滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗

可選用兔、豚鼠或大鼠。給藥后觀察動物全身狀況（如呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)）及局部刺激癥狀（如哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等癥狀）等。單次給藥24小時后或多次給藥停藥后24小時處死動物，觀察呼吸道局部（鼻、喉、氣管、支氣管）粘膜組織有無充血、紅腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

4.3陰道刺激性試驗

通常選用大鼠、兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動物種屬的最大給藥量。給藥頻率根據(jù)臨床應(yīng)用情況，通常每天1~2次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少4小時。觀察內(nèi)容：陰道部位、臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和陰道分泌物（如血、粘液）等，給藥后動物死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無充血、水腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行陰道和生殖系統(tǒng)病理組織學(xué)檢查等。

4.4直腸刺激性試驗

通常選兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動物種屬的最大可行量。給藥頻率根據(jù)臨床擬用情況，通常每天1~2次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少2~4小時，必要時可封閉一定時間。觀察內(nèi)容：包括肛門區(qū)域和肛門括約肌，給藥后臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和糞便（如血、粘液），給藥后死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無充血、水腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行肛周組織的病理組織學(xué)檢查。

4.5口腔用藥、滴耳劑等刺激性試驗

可參照上述試驗，給藥途徑為口腔、外耳道給藥，觀察對口腔和喉粘膜，以及對外耳道和鼓膜等的影響?？谇挥盟幗ㄗh用金黃倉鼠，觀察受試物對頰粘膜的刺激性。

05皮膚給藥光毒性試驗

成年白色豚鼠，雌雄各半。每組動物數(shù)至少6只。應(yīng)設(shè)陰性、陽性對照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床用藥濃度。

試驗前動物備皮涂敷藥物。給藥30分鐘后覆蓋固定，UV光源照射（UVA波長為320-400nm，如含UVB，其劑量不得超過0.1J/cm²）。試驗結(jié)束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng)，根據(jù)表7計算評分。單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和≥2的動物數(shù)≥1只時，判為受試物具有光毒性。

表7  皮膚反應(yīng)的評分標(biāo)準(zhǔn)

注意事項：

刺激性試驗應(yīng)重視給藥濃度、體積、速度、次數(shù)與有效暴露時間對結(jié)果的影響。注射劑的給藥濃度、速度及次數(shù)與藥物的血管刺激性密切相關(guān)，建議根據(jù)受試物的性質(zhì)、臨床用藥情況，采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎM最大可能地暴露毒性，如可適當(dāng)增加濃度，或通過增加給藥次數(shù)等。

參考文獻(xiàn)

1.藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則

2.藥物毒理學(xué)實驗方法與技術(shù)

刺激性試驗方法：

01血管刺激性試驗

通常選兔，每組不少于3只。設(shè)生理鹽水和/或溶媒對照，可采用同體左右側(cè)自身對比法。給藥部位根據(jù)臨床擬用途徑確定，一般選用耳緣靜脈。可設(shè)多個給藥濃度，至少包括臨床最大擬用濃度，給藥容積、速率和期限一般根據(jù)臨床擬用法用量，并根據(jù)動物情況進(jìn)行調(diào)整，給藥體積不可太低。多次給藥時間一般不超過7天。

根據(jù)受試藥物的特點和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時間和剖檢時間，至少觀察72小時。應(yīng)對部分動物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。恢復(fù)期動物根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)情況，繼續(xù)觀察14～21天進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)肉眼觀察和組織病理學(xué)檢查結(jié)果綜合判斷受試物的血管刺激性及刺激性恢復(fù)情況。

02肌肉刺激性試驗

通常選兔，也可選用大鼠。每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對照或/和溶媒對照組，可采用同體左右側(cè)自身對比法。根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時間, 觀察期結(jié)束時應(yīng)對部分動物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。分別在左右兩側(cè)股四頭肌內(nèi)注射給藥，觀察給藥后不同時間的局部反應(yīng)，如充血、紅腫等。給藥后48～72小時剖檢觀察注射局部的刺激反應(yīng)，按表1計算相應(yīng)的反應(yīng)級，并進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查，提供病理照片。

根據(jù)表1計算肌肉刺激性總反應(yīng)級，計算平均值，按表2判定刺激等級。若各股四頭肌反應(yīng)級的最高與最低之差大于2，應(yīng)另取動物重新試驗。

表1  肌肉刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)

表2  平均分值和等級

03皮膚刺激性試驗

定義：皮膚刺激性是指經(jīng)皮膚給藥后，在皮膚上產(chǎn)生的可逆性炎性病變。若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。皮膚刺激性試驗是觀察動物的皮膚接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出等局部反應(yīng)。

通常選兔、小型豬，否則應(yīng)闡明合理性。兔每組不低于4只。一般應(yīng)進(jìn)行相同備皮面積的正常皮膚和破損皮膚局部刺激性試驗。

采用同體左右側(cè)自身對比法，將受試物直接涂于備皮處，敷料覆蓋固定。貼敷時間至少4小時。多次給藥皮膚刺激性試驗應(yīng)連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時間相同，給藥期限一般不超過4周。破損皮膚試驗中皮膚破損程度以損傷表皮層為限。

在自然光線或全光譜燈光下肉眼觀察皮膚反應(yīng)。根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時間。通常單次給藥皮膚刺激性試驗觀察時間點為去除藥物后30～60分鐘，24、48和72小時。多次給藥皮膚刺激性試驗，為每次去除藥物后1小時以及每次給藥前，以及末次貼敷去除藥物后30～60分鐘，24、48和72小時。

如存在持久性損傷，有必要延長觀察期限以評價恢復(fù)情況和時間，延長期一般不超過2周。對出現(xiàn)中度及中度以上皮膚刺激性的動物應(yīng)在觀察期結(jié)束時進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，并提供病理照片。

單次給藥皮膚刺激性試驗，計算各組每一時間點皮膚反應(yīng)積分的平均值，按表3進(jìn)行刺激強(qiáng)度評價。多次給藥皮膚刺激性試驗，首先計算每一觀察時間點各組積分均值，然后計算觀察期限內(nèi)每天每只動物刺激積分均值，按表4進(jìn)行刺激強(qiáng)度評價。

表3  皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

表4  皮膚刺激強(qiáng)度評價標(biāo)準(zhǔn)

04粘膜刺激性試驗

4.1眼刺激性試驗

通常選兔，每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對照組，可采用同體左右側(cè)自身對比法。動物眼睛滴入受試物，保證藥物充分暴露。給藥期限應(yīng)根據(jù)臨床擬用方法確定。多次給藥時每天給藥次數(shù)應(yīng)不少于臨床用藥頻率。

應(yīng)根據(jù)受試物的特點和刺激性反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)挠^察時間。通常單次給藥為給藥后1、2、4、24、48和72小時；多次給藥眼刺激試驗為每天給藥前以及最后一次給藥后1、2、4、24、48和72小時。如存在持久性損傷，有必要延長觀察期限，一般不超過21天。

一般采用裂隙燈進(jìn)行眼刺激反應(yīng)檢查，也可根據(jù)刺激性反應(yīng)情況采用其他的合適器械。在整個觀察過程中應(yīng)進(jìn)行熒光素鈉染色檢查。每次檢查都應(yīng)記錄眼部異常反應(yīng)，根據(jù)表5計算分值。根據(jù)表6判斷刺激程度。

表5  眼刺激反應(yīng)分值標(biāo)準(zhǔn)

表6  眼刺激性評價標(biāo)準(zhǔn)

4.2滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗

可選用兔、豚鼠或大鼠。給藥后觀察動物全身狀況（如呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)）及局部刺激癥狀（如哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等癥狀）等。單次給藥24小時后或多次給藥停藥后24小時處死動物，觀察呼吸道局部（鼻、喉、氣管、支氣管）粘膜組織有無充血、紅腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

4.3陰道刺激性試驗

通常選用大鼠、兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動物種屬的最大給藥量。給藥頻率根據(jù)臨床應(yīng)用情況，通常每天1~2次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少4小時。觀察內(nèi)容：陰道部位、臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和陰道分泌物（如血、粘液）等，給藥后動物死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無充血、水腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行陰道和生殖系統(tǒng)病理組織學(xué)檢查等。

4.4直腸刺激性試驗

通常選兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動物種屬的最大可行量。給藥頻率根據(jù)臨床擬用情況，通常每天1~2次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少2~4小時，必要時可封閉一定時間。觀察內(nèi)容：包括肛門區(qū)域和肛門括約肌，給藥后臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和糞便（如血、粘液），給藥后死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無充血、水腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行肛周組織的病理組織學(xué)檢查。

4.5口腔用藥、滴耳劑等刺激性試驗

可參照上述試驗，給藥途徑為口腔、外耳道給藥，觀察對口腔和喉粘膜，以及對外耳道和鼓膜等的影響?？谇挥盟幗ㄗh用金黃倉鼠，觀察受試物對頰粘膜的刺激性。

05皮膚給藥光毒性試驗

成年白色豚鼠，雌雄各半。每組動物數(shù)至少6只。應(yīng)設(shè)陰性、陽性對照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床用藥濃度。

試驗前動物備皮涂敷藥物。給藥30分鐘后覆蓋固定，UV光源照射（UVA波長為320-400nm，如含UVB，其劑量不得超過0.1J/cm²）。試驗結(jié)束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng)，根據(jù)表7計算評分。單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和≥2的動物數(shù)≥1只時，判為受試物具有光毒性。

表7  皮膚反應(yīng)的評分標(biāo)準(zhǔn)

注意事項：

刺激性試驗應(yīng)重視給藥濃度、體積、速度、次數(shù)與有效暴露時間對結(jié)果的影響。注射劑的給藥濃度、速度及次數(shù)與藥物的血管刺激性密切相關(guān)，建議根據(jù)受試物的性質(zhì)、臨床用藥情況，采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎM最大可能地暴露毒性，如可適當(dāng)增加濃度，或通過增加給藥次數(shù)等。

參考文獻(xiàn)

1.藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則

2.藥物毒理學(xué)實驗方法與技術(shù)