刺激性試驗(yàn)

定義：

   刺激性是指非口服給藥制劑給藥后對(duì)給藥部位產(chǎn)生的可逆性炎癥反應(yīng)，若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。刺激性試驗(yàn)是觀察動(dòng)物的血管、肌肉、皮膚、粘膜等部位接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應(yīng)。

SPRING DRFAMS

刺激性試驗(yàn)

定義：

   刺激性是指非口服給藥制劑給藥后對(duì)給藥部位產(chǎn)生的可逆性炎癥反應(yīng)，若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。刺激性試驗(yàn)是觀察動(dòng)物的血管、肌肉、皮膚、粘膜等部位接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應(yīng)。

SPRING DRFAMS

刺激性試驗(yàn)方法：

01血管刺激性試驗(yàn)

通常選兔，每組不少于3只。設(shè)生理鹽水和/或溶媒對(duì)照，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。給藥部位根據(jù)臨床擬用途徑確定，一般選用耳緣靜脈?？稍O(shè)多個(gè)給藥濃度，至少包括臨床最大擬用濃度，給藥容積、速率和期限一般根據(jù)臨床擬用法用量，并根據(jù)動(dòng)物情況進(jìn)行調(diào)整，給藥體積不可太低。多次給藥時(shí)間一般不超過(guò)7天。

根據(jù)受試藥物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時(shí)間和剖檢時(shí)間，至少觀察72小時(shí)。應(yīng)對(duì)部分動(dòng)物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查?；謴?fù)期動(dòng)物根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況，繼續(xù)觀察14～21天進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)肉眼觀察和組織病理學(xué)檢查結(jié)果綜合判斷受試物的血管刺激性及刺激性恢復(fù)情況。

02肌肉刺激性試驗(yàn)

通常選兔，也可選用大鼠。每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對(duì)照或/和溶媒對(duì)照組，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時(shí)間, 觀察期結(jié)束時(shí)應(yīng)對(duì)部分動(dòng)物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。分別在左右兩側(cè)股四頭肌內(nèi)注射給藥，觀察給藥后不同時(shí)間的局部反應(yīng)，如充血、紅腫等。給藥后48～72小時(shí)剖檢觀察注射局部的刺激反應(yīng)，按表1計(jì)算相應(yīng)的反應(yīng)級(jí)，并進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查，提供病理照片。

根據(jù)表1計(jì)算肌肉刺激性總反應(yīng)級(jí)，計(jì)算平均值，按表2判定刺激等級(jí)。若各股四頭肌反應(yīng)級(jí)的最高與最低之差大于2，應(yīng)另取動(dòng)物重新試驗(yàn)。

表1  肌肉刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表2  平均分值和等級(jí)

03皮膚刺激性試驗(yàn)

定義：皮膚刺激性是指經(jīng)皮膚給藥后，在皮膚上產(chǎn)生的可逆性炎性病變。若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。皮膚刺激性試驗(yàn)是觀察動(dòng)物的皮膚接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出等局部反應(yīng)。

通常選兔、小型豬，否則應(yīng)闡明合理性。兔每組不低于4只。一般應(yīng)進(jìn)行相同備皮面積的正常皮膚和破損皮膚局部刺激性試驗(yàn)。

采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，將受試物直接涂于備皮處，敷料覆蓋固定。貼敷時(shí)間至少4小時(shí)。多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)應(yīng)連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時(shí)間相同，給藥期限一般不超過(guò)4周。破損皮膚試驗(yàn)中皮膚破損程度以損傷表皮層為限。

在自然光線或全光譜燈光下肉眼觀察皮膚反應(yīng)。根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時(shí)間。通常單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)觀察時(shí)間點(diǎn)為去除藥物后30～60分鐘，24、48和72小時(shí)。多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)，為每次去除藥物后1小時(shí)以及每次給藥前，以及末次貼敷去除藥物后30～60分鐘，24、48和72小時(shí)。

如存在持久性損傷，有必要延長(zhǎng)觀察期限以評(píng)價(jià)恢復(fù)情況和時(shí)間，延長(zhǎng)期一般不超過(guò)2周。對(duì)出現(xiàn)中度及中度以上皮膚刺激性的動(dòng)物應(yīng)在觀察期結(jié)束時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，并提供病理照片。

單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)，計(jì)算各組每一時(shí)間點(diǎn)皮膚反應(yīng)積分的平均值，按表3進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)，首先計(jì)算每一觀察時(shí)間點(diǎn)各組積分均值，然后計(jì)算觀察期限內(nèi)每天每只動(dòng)物刺激積分均值，按表4進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。

表3  皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表4  皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

04粘膜刺激性試驗(yàn)

4.1眼刺激性試驗(yàn)

通常選兔，每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對(duì)照組，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。動(dòng)物眼睛滴入受試物，保證藥物充分暴露。給藥期限應(yīng)根據(jù)臨床擬用方法確定。多次給藥時(shí)每天給藥次數(shù)應(yīng)不少于臨床用藥頻率。

應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)挠^察時(shí)間。通常單次給藥為給藥后1、2、4、24、48和72小時(shí)；多次給藥眼刺激試驗(yàn)為每天給藥前以及最后一次給藥后1、2、4、24、48和72小時(shí)。如存在持久性損傷，有必要延長(zhǎng)觀察期限，一般不超過(guò)21天。

一般采用裂隙燈進(jìn)行眼刺激反應(yīng)檢查，也可根據(jù)刺激性反應(yīng)情況采用其他的合適器械。在整個(gè)觀察過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行熒光素鈉染色檢查。每次檢查都應(yīng)記錄眼部異常反應(yīng)，根據(jù)表5計(jì)算分值。根據(jù)表6判斷刺激程度。

表5  眼刺激反應(yīng)分值標(biāo)準(zhǔn)

表6  眼刺激性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

4.2滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗(yàn)

可選用兔、豚鼠或大鼠。給藥后觀察動(dòng)物全身狀況（如呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)）及局部刺激癥狀（如哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等癥狀）等。單次給藥24小時(shí)后或多次給藥停藥后24小時(shí)處死動(dòng)物，觀察呼吸道局部（鼻、喉、氣管、支氣管）粘膜組織有無(wú)充血、紅腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

4.3陰道刺激性試驗(yàn)

通常選用大鼠、兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動(dòng)物種屬的最大給藥量。給藥頻率根據(jù)臨床應(yīng)用情況，通常每天1~2次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少4小時(shí)。觀察內(nèi)容：陰道部位、臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和陰道分泌物（如血、粘液）等，給藥后動(dòng)物死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無(wú)充血、水腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行陰道和生殖系統(tǒng)病理組織學(xué)檢查等。

4.4直腸刺激性試驗(yàn)

通常選兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動(dòng)物種屬的最大可行量。給藥頻率根據(jù)臨床擬用情況，通常每天1~2次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少2~4小時(shí)，必要時(shí)可封閉一定時(shí)間。觀察內(nèi)容：包括肛門(mén)區(qū)域和肛門(mén)括約肌，給藥后臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和糞便（如血、粘液），給藥后死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無(wú)充血、水腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行肛周組織的病理組織學(xué)檢查。

4.5口腔用藥、滴耳劑等刺激性試驗(yàn)

可參照上述試驗(yàn)，給藥途徑為口腔、外耳道給藥，觀察對(duì)口腔和喉粘膜，以及對(duì)外耳道和鼓膜等的影響?？谇挥盟幗ㄗh用金黃倉(cāng)鼠，觀察受試物對(duì)頰粘膜的刺激性。

05皮膚給藥光毒性試驗(yàn)

成年白色豚鼠，雌雄各半。每組動(dòng)物數(shù)至少6只。應(yīng)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床用藥濃度。

試驗(yàn)前動(dòng)物備皮涂敷藥物。給藥30分鐘后覆蓋固定，UV光源照射（UVA波長(zhǎng)為320-400nm，如含UVB，其劑量不得超過(guò)0.1J/cm²）。試驗(yàn)結(jié)束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng)，根據(jù)表7計(jì)算評(píng)分。單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和≥2的動(dòng)物數(shù)≥1只時(shí)，判為受試物具有光毒性。

表7  皮膚反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

注意事項(xiàng)：

刺激性試驗(yàn)應(yīng)重視給藥濃度、體積、速度、次數(shù)與有效暴露時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響。注射劑的給藥濃度、速度及次數(shù)與藥物的血管刺激性密切相關(guān)，建議根據(jù)受試物的性質(zhì)、臨床用藥情況，采用適當(dāng)?shù)姆椒?，盡最大可能地暴露毒性，如可適當(dāng)增加濃度，或通過(guò)增加給藥次數(shù)等。

參考文獻(xiàn)

1.藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則

2.藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

刺激性試驗(yàn)方法：

01血管刺激性試驗(yàn)

通常選兔，每組不少于3只。設(shè)生理鹽水和/或溶媒對(duì)照，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。給藥部位根據(jù)臨床擬用途徑確定，一般選用耳緣靜脈。可設(shè)多個(gè)給藥濃度，至少包括臨床最大擬用濃度，給藥容積、速率和期限一般根據(jù)臨床擬用法用量，并根據(jù)動(dòng)物情況進(jìn)行調(diào)整，給藥體積不可太低。多次給藥時(shí)間一般不超過(guò)7天。

根據(jù)受試藥物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時(shí)間和剖檢時(shí)間，至少觀察72小時(shí)。應(yīng)對(duì)部分動(dòng)物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查?；謴?fù)期動(dòng)物根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況，繼續(xù)觀察14～21天進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)肉眼觀察和組織病理學(xué)檢查結(jié)果綜合判斷受試物的血管刺激性及刺激性恢復(fù)情況。

02肌肉刺激性試驗(yàn)

通常選兔，也可選用大鼠。每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對(duì)照或/和溶媒對(duì)照組，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時(shí)間, 觀察期結(jié)束時(shí)應(yīng)對(duì)部分動(dòng)物進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。分別在左右兩側(cè)股四頭肌內(nèi)注射給藥，觀察給藥后不同時(shí)間的局部反應(yīng)，如充血、紅腫等。給藥后48～72小時(shí)剖檢觀察注射局部的刺激反應(yīng)，按表1計(jì)算相應(yīng)的反應(yīng)級(jí)，并進(jìn)行局部組織病理學(xué)檢查，提供病理照片。

根據(jù)表1計(jì)算肌肉刺激性總反應(yīng)級(jí)，計(jì)算平均值，按表2判定刺激等級(jí)。若各股四頭肌反應(yīng)級(jí)的最高與最低之差大于2，應(yīng)另取動(dòng)物重新試驗(yàn)。

表1  肌肉刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表2  平均分值和等級(jí)

03皮膚刺激性試驗(yàn)

定義：皮膚刺激性是指經(jīng)皮膚給藥后，在皮膚上產(chǎn)生的可逆性炎性病變。若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。皮膚刺激性試驗(yàn)是觀察動(dòng)物的皮膚接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出等局部反應(yīng)。

通常選兔、小型豬，否則應(yīng)闡明合理性。兔每組不低于4只。一般應(yīng)進(jìn)行相同備皮面積的正常皮膚和破損皮膚局部刺激性試驗(yàn)。

采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，將受試物直接涂于備皮處，敷料覆蓋固定。貼敷時(shí)間至少4小時(shí)。多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)應(yīng)連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時(shí)間相同，給藥期限一般不超過(guò)4周。破損皮膚試驗(yàn)中皮膚破損程度以損傷表皮層為限。

在自然光線或全光譜燈光下肉眼觀察皮膚反應(yīng)。根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)情況選擇觀察時(shí)間。通常單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)觀察時(shí)間點(diǎn)為去除藥物后30～60分鐘，24、48和72小時(shí)。多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)，為每次去除藥物后1小時(shí)以及每次給藥前，以及末次貼敷去除藥物后30～60分鐘，24、48和72小時(shí)。

如存在持久性損傷，有必要延長(zhǎng)觀察期限以評(píng)價(jià)恢復(fù)情況和時(shí)間，延長(zhǎng)期一般不超過(guò)2周。對(duì)出現(xiàn)中度及中度以上皮膚刺激性的動(dòng)物應(yīng)在觀察期結(jié)束時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，并提供病理照片。

單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)，計(jì)算各組每一時(shí)間點(diǎn)皮膚反應(yīng)積分的平均值，按表3進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)，首先計(jì)算每一觀察時(shí)間點(diǎn)各組積分均值，然后計(jì)算觀察期限內(nèi)每天每只動(dòng)物刺激積分均值，按表4進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。

表3  皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表4  皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

04粘膜刺激性試驗(yàn)

4.1眼刺激性試驗(yàn)

通常選兔，每組不少于3只。應(yīng)設(shè)生理鹽水對(duì)照組，可采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法。動(dòng)物眼睛滴入受試物，保證藥物充分暴露。給藥期限應(yīng)根據(jù)臨床擬用方法確定。多次給藥時(shí)每天給藥次數(shù)應(yīng)不少于臨床用藥頻率。

應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)和刺激性反應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)挠^察時(shí)間。通常單次給藥為給藥后1、2、4、24、48和72小時(shí)；多次給藥眼刺激試驗(yàn)為每天給藥前以及最后一次給藥后1、2、4、24、48和72小時(shí)。如存在持久性損傷，有必要延長(zhǎng)觀察期限，一般不超過(guò)21天。

一般采用裂隙燈進(jìn)行眼刺激反應(yīng)檢查，也可根據(jù)刺激性反應(yīng)情況采用其他的合適器械。在整個(gè)觀察過(guò)程中應(yīng)進(jìn)行熒光素鈉染色檢查。每次檢查都應(yīng)記錄眼部異常反應(yīng)，根據(jù)表5計(jì)算分值。根據(jù)表6判斷刺激程度。

表5  眼刺激反應(yīng)分值標(biāo)準(zhǔn)

表6  眼刺激性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

4.2滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗(yàn)

可選用兔、豚鼠或大鼠。給藥后觀察動(dòng)物全身狀況（如呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)）及局部刺激癥狀（如哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等癥狀）等。單次給藥24小時(shí)后或多次給藥停藥后24小時(shí)處死動(dòng)物，觀察呼吸道局部（鼻、喉、氣管、支氣管）粘膜組織有無(wú)充血、紅腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

4.3陰道刺激性試驗(yàn)

通常選用大鼠、兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動(dòng)物種屬的最大給藥量。給藥頻率根據(jù)臨床應(yīng)用情況，通常每天1~2次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少4小時(shí)。觀察內(nèi)容：陰道部位、臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和陰道分泌物（如血、粘液）等，給藥后動(dòng)物死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無(wú)充血、水腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行陰道和生殖系統(tǒng)病理組織學(xué)檢查等。

4.4直腸刺激性試驗(yàn)

通常選兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動(dòng)物種屬的最大可行量。給藥頻率根據(jù)臨床擬用情況，通常每天1~2次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少2~4小時(shí)，必要時(shí)可封閉一定時(shí)間。觀察內(nèi)容：包括肛門(mén)區(qū)域和肛門(mén)括約肌，給藥后臨床表現(xiàn)（如疼痛癥狀）和糞便（如血、粘液），給藥后死亡和剖檢結(jié)果，局部組織有無(wú)充血、水腫等現(xiàn)象，并進(jìn)行肛周組織的病理組織學(xué)檢查。

4.5口腔用藥、滴耳劑等刺激性試驗(yàn)

可參照上述試驗(yàn)，給藥途徑為口腔、外耳道給藥，觀察對(duì)口腔和喉粘膜，以及對(duì)外耳道和鼓膜等的影響?？谇挥盟幗ㄗh用金黃倉(cāng)鼠，觀察受試物對(duì)頰粘膜的刺激性。

05皮膚給藥光毒性試驗(yàn)

成年白色豚鼠，雌雄各半。每組動(dòng)物數(shù)至少6只。應(yīng)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床用藥濃度。

試驗(yàn)前動(dòng)物備皮涂敷藥物。給藥30分鐘后覆蓋固定，UV光源照射（UVA波長(zhǎng)為320-400nm，如含UVB，其劑量不得超過(guò)0.1J/cm²）。試驗(yàn)結(jié)束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng)，根據(jù)表7計(jì)算評(píng)分。單純涂受試物而未經(jīng)照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng)，而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和≥2的動(dòng)物數(shù)≥1只時(shí)，判為受試物具有光毒性。

表7  皮膚反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

注意事項(xiàng)：

刺激性試驗(yàn)應(yīng)重視給藥濃度、體積、速度、次數(shù)與有效暴露時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響。注射劑的給藥濃度、速度及次數(shù)與藥物的血管刺激性密切相關(guān)，建議根據(jù)受試物的性質(zhì)、臨床用藥情況，采用適當(dāng)?shù)姆椒?，盡最大可能地暴露毒性，如可適當(dāng)增加濃度，或通過(guò)增加給藥次數(shù)等。

參考文獻(xiàn)

1.藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則

2.藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)